博尔森生物生产的 ELISA 试剂盒采用“夹心法 ”:将捕获抗体包被于酶标板上,捕获样品及标 准品中的靶蛋白,生物素化的检测抗体与靶蛋白结合, SABC 复合物与生物素化检测抗体结  合,形成免疫复合物,加入 TMB 显色液后,若反应孔中有靶蛋白则显蓝色,加入终止液变黄  色,检测过程中游离的成分均被洗去,用酶标仪在450 nm 处测OD 值,靶蛋白浓度与OD 值之 间呈正比,通过绘制标准曲线计算出标本中靶蛋白的浓度。

按操作顺序形成抗体夹心结构后,加入TMB 底物,板孔液体由无色变成蓝色,再加入终止液 液体变为黄色后进行吸光度值测定。

双抗体夹心模式图

试剂盒组分:(保存温度4℃)

实验所需材料

酶标仪,包含450nm测定波长,建议配置包含600-680nm校正波长,采用双波长检测;

移液器及枪头、蒸馏水或去离子水、计量器具、带刻度的烧杯、量筒等耗材和容器具;

水平轨道微孔板振荡器、计时器、瓶、排枪或微孔板洗板机等辅助;

用于稀释校准品和样品的离心管、干净的吸水纸、以及其他实验可能需要用到的器具;

标本收集及试剂准备:

1、样品预处理

下面列出的样品收集和储存条件旨在作为一般性指导。样品稳定性尚未评估。

a) 细胞培养上清液:在 1000×g 下离心 15 分钟去除颗粒,立即进行测定或等分装样品,并 将样品储存在≤-20℃的温度下。避免重复冻融循环。(细胞培养上清液样品建议 2 倍稀 释。例如:100 μL 样品+100 μL 的 1×稀释液) 

b) 血清:使用血清分离管,使样品在室温下凝结 30 分钟,然后在 1000×g 下离心 15 分钟。 立即取出血清并进行测定或等分装样品,将样品储存在≤-20℃的温度下。避免重复冻融 循环。(血清样品建议 2 倍稀释。例如:50 μL 样品+50 μL 的 1×稀释液)

c) 血浆:使用EDTA 或肝素作为抗凝剂收集血浆。收集后 30 分钟内,以 1000×g 离心 15 分 钟。立即测定或等分装样品,并将样品储存在≤-20℃的温度下。避免重复冻融循环。

(血浆样品建议 2 倍稀释。例如:50μL 样品+50 μL 的 1×稀释液)注:柠檬酸盐抗凝剂 血浆未经验证可用于本试验,使用时应自行验证可行性。溶血的样品不适合用于该测定。

d) 组织匀浆:用预冷的 PBS(0.01M,pH=7.4)冲洗组织,去除残留血液(匀浆中裂解的红细胞 会影响检测结果),称重后将组织剪碎。将剪碎的组织与对应体积的 PBS(一般按 1:9 的 重量体积比,比如 1g 的组织样品对应9mL 的 PBS,具体体积可根据实验需要适当调整,并做好记录。推荐在 PBS 中加入蛋白酶抑制剂)加入玻璃匀浆器中,于冰上充分研磨或 匀浆机研磨。为了进一步裂解组织细胞,可以对匀浆液进行超声破碎,或反复冻融。最 后将匀浆液于 5000×g 离心 5-10 分钟,取上清检测。

e) 细胞裂解液:贴壁细胞用预冷 PBS 轻轻清洗,然后用胰蛋白酶消化,1000×g 离心 5 分钟 后收集细胞;悬浮细胞可直接离心收集。收集的细胞用预冷 PBS 清洗 3 次,每 1×106 个 细胞中加入 150-200 μL 的 PBS 重悬(推荐在 PBS 中加入蛋白酶抑制剂;若含量很低可适 当减少 PBS 体积)并通过反复冻融或超声使细胞破碎。将提取液于 2-8℃ , 1500×g 离心10 分钟,取上清检测。

f) 其它样本类型:1000×g 离心 20 分钟,取上清即可检测。

2、洗涤液/稀释液配置

如果洗涤液/稀释液(20×) 有晶体析出,需在 37℃下加热?晶体全部溶解。用蒸馏水 1:20 稀释(例如:1mL 浓缩洗涤液/稀释液加入 19mL 的蒸馏水)

3、标准品配置

取 8 个 1.5ml 离心管,分别标注 S1,S2,S3,S4,S5,S6,S7,blank,第一管 S1 中加入标准品/ 样品稀释液900ul,第二至第八管中分别加入标准品/样品稀释液 200ul,在第一管中加入标准品溶液(100ng/ml)100ul 置于漩涡混合器上混匀后用加样器吸出 200ul,移至第二管,如此反复作对倍稀释至S7,第八管为空白对照。配置好的标准曲线浓度为:10、5、2.5、1.25、0.625、0.313、0.157、0ng/ml(标准品的用量及标准曲线范围也可根据自己需要配置)。

4、生物素化抗体工作液配置

使用前 20 分钟,用生物素化抗体稀释液将 100×生物素化抗体稀释成 1×工作液,根据所需 用量配置,当日使用,剩余弃之。

5、SABC 工作液配置

使用前 20 分钟,用 SABC 稀释液将 100×SABC 稀释成 1×工作液,根据所需用量配置,当日 使用,剩余弃之

6、如果您检测的样本中靶蛋白浓度高于标准品最高值,建议重新检测,请根据实际情况,适 当倍数稀释(建议做预实验,以确定稀释倍数)。

检测程序:

1. 加样:空白孔加入 100 μ l 标准品/样品稀释液,其余孔各加入标准品或待测样品 100ul, 将反应板混匀后置 37℃ , 60 分钟。

2. 洗板:用 1×洗涤液将反应板充分洗涤 3 次,每孔加入 1×洗液 300 μ l,每次震荡/浸泡 1-2 分钟,向滤纸上印干。

3. 空白孔加入 100ul标准品/样品稀释液,其余孔各加入 1×的生物素化抗体工作液 100ul, 混匀后置 37℃ , 60 分钟。

4. 洗板:同上。

5. 每孔加入 SABC 工作液 100ul,混匀后置 37℃ , 30 分钟。

6. 洗板:同上。

7. 每孔加入 TMB 显色底物 100ul,混匀后置 37 ℃暗处反应 10-20 分钟(具体显色时间根据 显色结果而定)。

8. 每孔加入 50ul 终止液,混匀,5 分钟内用酶标仪在 450nm 处测吸光值。

结果判断和计算

1. 所有 OD 值建议减除空白孔值后再进行计算,如空白孔 OD 低于0.1,也可以直接计算。

2. 以标准品浓度作横坐标,OD 值作纵坐标,手工绘制或用软件绘制标准曲线,根据样品 OD 值计算出相应含量,再乘以稀释倍数即可。