小鼠Ki-67蛋白(Ki67P) ELISA Kit

检测原理:

博尔森生物(BIOESN)生产的ELISA试剂盒采用抗体夹心法:将抗某蛋白抗体包被于酶标板上,标本和标准品中的某蛋白与抗体结合,加入生物素化的抗某蛋白抗体,再加入SABC复合物与生物素抗体结合,形成免疫复合物,然后加入TMB显色底物,显色剂显蓝色,最后加终止液变黄色,游离的成分被洗去。在450 nm处测OD值,某蛋白浓度与OD值之间呈正比,可通过绘制标准曲线计算出标本中某蛋白的浓度。

试剂盒组分: (保存温度4℃)

本试剂盒用于血清、血浆、组织匀浆、细胞培养上清液及其它生物体液。

标本收集与试剂准备: 

1. 血清、血浆样本收集应使用一次性的无热原,无内毒素试管(EDTA、柠檬酸盐、肝素抗凝均可),血清、血浆避免使用溶血,高血脂标本,标本悬浮物应离心去除,使标本清澈透明。待测样本应尽早检测,2-8℃保存48小时;更长时间须冷冻(-20℃或-80℃)保存,避免反复冻融。

2. 洗涤液配置:用蒸馏水1:20稀释(示例:1ml浓缩洗涤液加入19ml的蒸馏水)

3. 标准品配制:取7个1.5ml离心管,分别标注1/2,1/4,1/8,1/16,1/32,1/64,blank。从第一至七管中分别加入标准品/样品稀释液200ul。在第一管中加入标准品溶液200ul,置于漩涡混合器上混匀后用加样器吸出200ul,移至第二管。如此反复作对倍稀释,从第六管中吸出200ul弃去,第七管为空白对照。

4.

5. 生物素化抗体工作液配置:使用前20分钟,用生物素化抗体稀释液将100×生物素化抗体稀释成1×工作液,根据所需用量配置,当日使用,剩余弃之。

6. TMB显色液的配置:使用前10分钟,将TMB显色液A液和B液1:1混合,避光放置备用。

7. 如果您检测的样本中靶蛋白浓度高于标准品最高值,建议重新检测,请根据实际情况,适当倍数稀释(建议做预实验,以确定稀释倍数)。

检测程序:

1. 加样:空白孔加入50μl标准品/样品稀释液,其余孔各加入标准品或待测样品50ul,将反应板混匀后置37℃,40分钟。

2. 洗板:用1×洗涤液将反应板充分洗涤4-6次,每孔加入1×洗液350μl,每次震荡/浸泡1-2分钟,向滤纸上印干。

3. 空白孔加入100ul生物素化抗体稀释液,其余孔各加入1×的生物素化抗体工作液100ul,混匀后置37℃,30分钟。

4. 洗板:同上。

5. 每孔加入SABC复合物工作液100ul,混匀后置37℃,20分钟。

6. 洗板:同上。

7. 每孔加入提前配置好的TMB混合液100ul,混匀后置37 ℃暗处反应10-20分钟(具体显色时间根据显色结果而定)。

8. 每孔加入100ul终止液,混匀,30分钟内用酶标仪在450nm处测吸光值。

结果判断与计算:

1. 所有OD值建议减除空白值后再行计算,如空白OD低于0.1,也可以直接计算。

2. 以标准品浓度作横坐标,OD值作纵坐标,手工绘制或用软件绘制标准曲线,根据样品OD值计算出相应含量,再乘上稀释倍数即可。

试剂盒性能:

    1、 检测范围:0.312-20ng/mL

    2、 特异性:同时可检测重组或天然的某种蛋白或抗体,不与其它细胞因子有交叉反应。

    3、 重复性:板内,板间变异系数均小于10%。

注意事项

1. 在试验中标准品和样本检测时建议作双孔检测,每次检测都应做标准曲线。

2. 洗涤过程很关键,洗涤不充分将导致精确度误差及OD值错误地升高,从冰箱中取出的浓缩洗涤液可能 有结晶,属于正常现象,37℃水浴使结晶完全溶解后再配制洗涤液。

3. 检测时所有试剂都要恢复到室温,板条开封后剩余板条需封好,放回袋中2 个月内用完。

4. 试剂盒使用超敏TMB溶液,若显色过深会出现絮状物,属正常现象,不影响结果判读。

5. 仅用于科研,不能用于临床诊断!